Тромбоспондин-1, содержащий домен 7А, при идиопатической мембранозной нефропатии

• Аннотация

РЕЗЮМЕ

Введение

Идиопатическая мембранозная нефропатия (ИМН) представляет собой аутоиммунное заболевание. Примерно у 70% больных идиопатическая мембранозная нефропатия ассоциирована с наличием аутоантител к рецептору фосфолипазы А2 типа 1 (PLA2R1). У остальных пациентов целевые антигены не известны.

Методы

С помощью иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга) мы исследовали образцы сыворотки пациентов с идиопатической мембранозной нефропатией, другими гломерулярными заболеваниями и здоровых добровольцев из контрольной группы на наличие антител к нативным гломерулярным белкам человека. Мы частично изолировали предполагаемый новый антиген, идентифицировав этот белок с помощью масс-спектрометрического анализа расщепленных белков, и подтвердили результаты анализом экспрессии рекомбинантного протеина, иммунопреципитации и иммуногистохимического исследования.

Результаты

В образцах сыворотки, полученной от 6 из 44 пациентов (европейская когорта) и 9 из 110 больных (бостонская когорта) с анти-PLA2R1-отрицательной идиопатической мембранозной нефропатией, был идентифицирован гломерулярный протеин с молекулярной массой 250 кДа. С этим антигеном не реагировали образцы сыворотки, полученной от 74 больных идиопатической мембранозной нефропатией, ассоциированной с наличием анти-PLA2R1-антител, от 76 больных с другими гломерулярными заболеваниями и от 44 здоровых добровольцев из контрольной группы. Несмотря на то, что этот впервые идентифицированный антиген явно отличается от PLA2R1, он имеет с ним несколько общих биохимических признаков, таких как наличие N-гликозилирования, локализацию на мембране и способность реагировать с сывороткой только в невосстановленном состоянии. С помощью масс-спектрометрии этот антиген был идентифицирован как тромбоспондин-1, содержащий домен 7А (THSD7A). Все прореагировавшие образцы сыворотки распознали рекомбинантный THSD7A и иммунопреципитированный THSD7A в гломерулярных лизатах. Более того, иммунохимическое исследование биоптатов выявило локализацию THSD7A на подоцитах, а IgG, элюированный из одного из этих образцов, был специфичен для THSD7A.

Выводы

В нашем исследовании у 15 из 154 пациентов с идиопатической мембранозной нефропатией были обнаружены циркулирующие антитела к THSD7A (но не к PLA2R1), из чего следует, что эти больные представляют собой отдельную подгруппу пациентов с идиопатической мембранозной нефропатией. (Выполнено при финансовой поддержке Французского национального центра по научным исследованиям и др.)

КОММЕНТАРИИ

Идиопатическая мембранозная нефропатия представляет собой аутоиммунное заболевание и является частой причиной развития нефротического синдрома у взрослых. В 2009 г. рецептор фосфолипазы А2 типа 1 (PLA2R1) – белок, экспрессируемый подоцитами почечных клубочков, был идентифицирован как основной антиген, вовлеченный в патогенез идиопатической мембранозной нефропатии у взрослых. Как подтвердилось в ряде последующих исследований, почти у 70% больных идиопатической мембранозной нефропатией обнаруживаются циркулирующие анти-PLA2R1-антитела. У оставшихся 30% пациентов с идиопатической мембранозной нефропатией отсутствуют явные вторичные причины заболевания.

Исследователи открыли новый антиген, вовлеченный в развитие мембранозной гломерулопатии, идентифицированный как тромбоспондин.

Диагноз мембранозной нефропатии был установлен при биопсии почки. Образцы сыворотки, полученные от пациентов с мембранозной нефропатией и другими гломерулярными заболеваниями, а также от здоровых добровольцев, были исследованы на наличие анти-PLA2R1-антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга).

Авторы исследовали образцы сыворотки пациентов с мембранозной нефропатией и здоровых добровольцев из соответствующей контрольной группы на наличие антител к общим белкам в гломерулярном экстракте. Реактивность сыворотки была исходно исследована методом иммуноблоттинга в невосстановленном состоянии в сыворотке, полученной от 65 больных мембранозной нефропатией (у 30 из которых отсутствовали анти-PLA2R1-антитела), 76 больных с другими заболеваниями почек (при аутоиммунных болезнях или проявляющихся протеинурией), и от 44 здоровых добровольцев. Все образцы, в которых присутствовали анти-PLA2R1-антитела (что ранее установили методом ELISA), при иммуноблоттинге реагировали с нативным и рекомбинантным PLA2R1.

В результате скрининга был идентифицировал предполагаемый аутоантиген с молекулярной массой, равной 250 кДа, присутствующий в нормальных клубочках почки человека. Этот белок гликозилирован в меньшей степени, чем PLA2R1, и экспрессируется практически исключительно на мембранах клеток, что дает основания рассматривать его как неизвестный ранее антиген, отличающийся от PLA2R1. С помощью сложного высокотехнологичного анализа авторы идентифицировали этот белок как тромбоспондин типа 1, содержащий домен 7А (THSD7A). Чтобы определить подкласс IgG в анти-THSD7A-антителах, авторы использовали вторичные антитела к подклассам IgG (IgG1-IgG4). Анти-THSD7A-антитела оказались представленными в основном подклассом IgG4, хотя другие подклассы IgG в незначительном количестве присутствовали в большинстве образцов сыворотки.

Иммунофлуоресцентное окрашивание биоптатов почки в группе здорового контроля анти-THSD7A-антителами продемонстрировало отчетливое линейное свечение THSD7A в клубочках.

PLA2R1-антиген, как известно, локализуется вместе с IgG4 в субэпителиальных депозитах у пациентов с PLA2R1-ассоциированной идиопатической мембранозной нефропатией. Аналогично этому, авторы обнаружили комплексы IgG4 и THSD7A в биоптатах у THSD7A-серопозитивных пациентов.

THSD7A – второй аутоантиген, вовлеченный в патогенез идиопатической мембранозной нефропатии у взрослых. Примерно у 2,5-5% больных идиопатической мембранозной нефропатией, которых мы обследовали, присутствовали антитела к THSD7A, что соответствовало 8-14% больных, у которых отсутствуют анти-PLA2R1-антитела.

THSD7A сконцентрированы в базальных отделах подоцита, их экспрессии в эндотелиальных клетках почечных клубочков не обнаружено. Эти результаты согласуются с недавно полученными данными, свидетельствующими, что THSD7A в бóльшем количестве экспрессируется в подоцитах по сравнению с эндотелиальными и мезангиальными клетками почечных клубочков.

Таким образом, авторы идентифицировали группу больных с идиопатической мембранозной нефропатией, у которых циркулирующие аутоантитела направлены против THSD7A, а не PLA2R1, что дает основание полагать, что пациенты с положительными антителами к THSD7A представляют собой отдельную подгруппу больных идиопатической мембранозной нефропатией. Это наблюдение не только способствует пониманию патофизиологических основ развития мембранозной нефропатии, но также дает потенциальную возможность идентификации и мониторирования больных с положительными анти-THSD7A-антителами путем определения антител в сыворотке (серологическое исследование) и антигенов в ткани (гистологическое окрашивание).

Жак ШАНАР (Jacques CHANARD)

Профессор нефрологии